|
|
Structural Studies on Extracellular Domains of adhesion G Protein-Coupled Receptor ADGRG4
Strnadová, Martina ; Márová, Ivana (referee) ; Mravec, Filip (advisor)
Bunková komunikácia je schopnosť buniek príjmať, vysielať a spracovávať signály zo svojho okolia. Môžeme teda hovoriť o komunikácii medzi bunkami a orgamizmom. Extracelulárne stimuly spúšťajú signál, ktorý interaguje s receptormi na bunkovom povrchu, čo má za následok aktiváciu intracelulárnych signálnych proteínov. Tieto proteíny sú rozdelené do viacerých rodín podľa ich špecifickej sekvencie, domén ktoré obsahujú, alebo ligandov, s ktorými interagujú. Jednou z týchto rodín je práve receptorová rodina adhezívnych receptorov spojených s G proteínom (aGPCR), ktorá obsahuje 33 členov. Najnovšie štúdie naznačujú, že fungujú z veľkej časti ako mechanoreceptory; avšak, pre niektorých členov boli identifikované aj ligandy pre ich aktiváciu. V porovnaní s inými GPCR sa táto rodina vyznačuje relatívne dlhou extracelulárnou oblasťou (ECR), ktorá obsahuje súbor rozličných štruktúrnych domén a motívov. ADGRG4 (GPR112) predstavuje jeden z najväčších aGPCR s dĺžkou reťazca väčšou ako 3000 aminokyselín (aa). Väčšina jeho reťazca aa sa nachádza v extracelulárnom priestore (viac ako 2500 aa). Je známe, že ADGRG4 je špecificky exprimovaný v enterochromafinných bunkách umiestnených v epiteli ľudského tenkého čreva. Tieto enteroendokrinné bunky sú zodpovedné za produkciu a sekréciu serotonínu a reagujú na chemické a mechanické podnety. K dnešnému dňu však fyziologická funkcia ADGRG4 v týchto bunkách zostáva neznáma. Cieľ tejto práce bol rozdelený na dve časti. V prvej časti bola snaha o poskytnutie štruktúrnych informácií o obrovskej extracelulárnej oblasti ADGRG4. ECR bola rozdelená na viacero častí pre lepšie skúmanie. Následne boli vzorky exprimované v ľudských embryonálnych obličkových bunkách 293 (HEK293S bunky). Výsledné proteínové štruktúry boli purifikované viacerými technikami. Pre zvýšenie možnosti kryštalizácie, bol purifikovaný proteín deglykozylovaný a až potom podrobený na kryštalizačné pokusy. Druhá časť sa zaoberala analýzou NTF-konštruktov, dobre preskúmaných ADGRs. Tieto konštrukty neobsahovali C-terminálny koniec (CTF), iba N-terminálnu časť (NTF). Desať rôznych proteínov bolo úspešne naklonovaných a expresovaných v HEK293T bunkách. Na vyhodnotenie výsledkov oligomerného stavu vzoriek z prvej aj druhej časti boli použité techniky Native PAGE a dynamický rozptyl svetla (DLS). Ako kontrola autoproteolýzy, ktorá je typickým znakom aGPCR, sa využili rozličné techniky Western blotting (WB). Metóda nano-diferenciačná skenovacia fluorescencia (DSF) sa využila na stanovenie pripravených konštruktov a na nájdenie optimálnych podmienok pre roztoky, ktoré sa v práci používali. Výsledky z prvej časti ukazujú za akých podmienok dokážeme nami vytvorený konštruk podrobiť kryštalizácii a následne ďalej pokračovať v jeho výskume. Druhá časť nám ukázala, ktoré nami klonované konštrukty sa dokážu stabilne expresovať v HEK293T bunkách. Na základe získaných parametrov z prvej a druhej časti dokáže výskum v tejto oblasti rozšíriť a do buducnosti získať dôležité informácie ohľadom týchto pozoruhodných receptorov.
|
|
|
Morphological and molecular characterization of yeasts from the genus \kur{Zygosaccharomyces} associated with honey bees
JAVŮRKOVÁ, Petra
Beekeeping is one of the oldest fields of human activity. A key role in this field is played by the honey bee (Apis mellifera), which is also an important pollinator of agricultural crops and wild plants. Although bees have evolved defense mechanisms during their long evolution against a variety of external influences, bee´s existence is currently threatened by several factors. An interesting way for increasing the immunity of the bee colony seems to be the honey bee microbiome. Honey bee microbiome is the main focus of this thesis, with a practical part focused on yeasts of the genus Zygosaccharomyces. Twenty samples/strains of the yeasts were isolated from the intestines of bee larvae, pollen baskets, and pollen on selected culture media. Based on sequencing of the D1/D2 region of the large ribosomal DNA subunit, three species of the genus Zygosaccharomyces were identified in these twenty samples: Z. rouxii, Z. favi and Z. mellis. Four pairs of primers were also designed within the ITS region and can be an alternative or complement to the molecular characterization of isolated yeast strains based on another marker region of DNA. All primers were evaluated as specific for Z. rouxii species. Using one pair of primers, the part of ITS region was also amplified in the species Z. mellis. According to this, these primers could also be used to identify this species as well. The last part of this work is the determination of ergosterol production in yeast biomass by HPLC. Ergosterol is produced by the Zygosaccharomyces yeasts and it plays an important role in the development of the bee brood. It was found in this thesis, that ergosterol levels in yeasts are not uniform and also do not correlate with biomass production. The highest production of ergosterol was found in the species Z. mellis, which is a sample obtained from pollen. The outputs of this work provide a new perspective on the colonization of the intestinal microbiota of bees and also offer potential significance for the future, especially in the application of yeast as a source of ergosterol for developing larvae.
|
|
|
Microbial consortia and metagenome of industrially polluted soil: occurrence of genes encoding AEH
Pitkina, Anastasiya ; Kyslík, Pavel (advisor) ; Lichá, Irena (referee)
Soils contain highly diverse consortia of bacteria making them very attractive starting points for both culture-dependent and metagenomic discovery efforts. The present diploma thesis analyses the composition of the microbial community from pharmaceutically polluted soil, with the employment of next-generation Illumina sequencing of 16S rDNA region. This analysis revealed high complexity of the soil microbial environment and confirmed that anthropogenic activity (represented by production of beta- lactam antibiotics) influences the variability and abundance of the species, yet without reducing the microbial diversity. In the second part of the thesis, isolation and heterologous expression of a novel gene encoding alpha-amino acid ester hydrolase (AEH) from a cultivable soil microorganism B. cereus is described. AEHs possess industrial potential for biocatalytic synthesis of semi-synthetic beta-lactam antibiotics, which are presently of great clinical importance. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
guest ::
